城市生活污水抗生素抗性基因污染研究

　　随着我国新型城镇化的不断推进以及城市人口的持续增加，城市生活污水和生活垃圾的产生量也不断增加.城市生活污水和生活垃圾填埋场产生的垃圾渗滤液是城市环境保护工作的重点和难点.抗生素在养殖、医疗保健等行业被广泛使用，并存在着过度使用、长期滥用等现象，并且产生了严重的环境抗生素抗性的问题，抗生素抗性基因在环境中不断传播与富集，严重危害人类健康与环境安全.各种环境介质中，包括猪场土壤[1, 2]、污泥堆肥[3, 4]、城市河流水体[5]、施用猪粪水稻土[6]，甚至自来水[7, 8]中也检测出环境抗生素抗性基因，环境抗生素抗性基因研究取得了一些进展[9]. Pruden等[10]2006年首次提出将抗生素抗性基因作为一种新型环境污染物，逐渐引起全球科学家和公众的高度关注.

　　城市生活污水主要是指城市生活中的各种餐厨污水、垃圾、粪便、洗涤剂等各种污染水体形成的混合污水，氮、磷、硫等营养元素含量较高，微生物含量高，并且含有病原微生物[11, 12].生活垃圾填埋场是城市生活垃圾、污水厂的处置污泥、电子废弃物、垃圾焚烧厂飞灰残渣等固体废弃物的主要最终堆放场所.垃圾渗滤液是伴随垃圾填埋场运营整个生命周期的“二次污染物”.生活垃圾渗滤液具有污染物成分复杂，污染物浓度高的特点，相较于城市生活污水，其高浓度的氨氮、有毒有害物质，重金属离子等特征形成了一个特殊环境，尤其是场龄大于5 a的垃圾渗滤液可生化性差[13].受人类生产生活的影响，城市生活污水和垃圾渗滤液中含有抗生素残留以及抗生素抗性的微生物，被认为是环境抗生素抗性的一个重要存储库[14~16].

　　由于垃圾渗滤深度处理后产生了难以处理的浓缩液，垃圾渗滤液(包括浓缩液)往往被运送到城市生活污水处理厂进行合并处理[13, 17].目前，城市生活污水处理过程中的抗生素抗性基因污染分布及演变有较多相关研究[18, 19]，并且主要是针对磺胺类、四环素类等少数几种抗生素抗性基因.针对城市生活污水(接收垃圾渗滤液进行合并处理)和生活垃圾渗滤液环境抗生素抗性的对比研究，从抗生素抗性谱的角度全面研究这两者间的抗性基因污染还没有或者比较少相关研究报道.因此，对城市生活污水和生活垃圾渗滤液中抗生素抗性种类、分布格局开展对比研究，比较两者之间的异同，综合分析研究城市生活污水和垃圾渗滤液抗生素抗性基因污染状况，对于加强城市生活污水和垃圾渗滤液管理与处置，评估两者的生态安全情势和环境风险显得十分必要.

　　1 材料与方法

　　1.1 样品采集及前处理

　　城市生活污水样品于2015年7月采集自厦门市某污水处理厂(接收厦门市东部固废处理中心生活垃圾填埋场部分的垃圾渗滤液和垃圾渗滤液处置后浓缩液)的进水样品1 L(3个采样平行样品)，其中添加了终浓度为50%乙醇进行预处理，用于固定污水中微生物.生活垃圾渗滤液采样地点位于厦门市东部固废处理中心生活垃圾填埋场，于2015年7月采集了垃圾渗滤液调节池末端，也是渗滤液处理站污水进口端样品1 L(3个采样平行样品)，同样在采集样品中添加了乙醇进行预处理.所采集的城市生活污水和生活垃圾渗滤液，存放在低温采样箱中并迅速转移至实验室的-20℃冰箱中保存，用于环境样品的DNA提取.

　　1.2 城市生活污水和生活垃圾渗滤液DNA提取

　　量取城市生活污水(raw wastewater，RWW)和生活垃圾渗滤液(raw leachate，RLC)各40 mL，分装到50 mL离心管中，使用12 000 r ·min-1转速离心10 min，倒掉上清液，每个离心管中再加入1 mL生理盐水，振荡并悬浮起离心管底部固体，从而达到清洗效果.再将离心管中的全部样品分别转移至新的1.5 mL离心管中，18 000 r ·min-1转速离心后，弃去上清液.然后加入FastDNA® Spin Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals，美国)中的PBS缓冲液(978 μL).

　　随后将上述含有采集样品的PBS缓冲液转移至试剂盒中的Lysing Matrix E tube，按照生产商提供的方法提取样品中的总DNA，然后用1%的琼脂糖凝胶进行电泳验证.样品所提取的DNA样品用QuantiFluor® dsDNA System(Promega Corporation，美国)试剂盒测定双链DNA浓度.根据测定的样品DNA浓度，实验样品用灭菌的超纯水统一稀释至50 ng ·μL-1.

　　1.3 高通量荧光定量PCR

　　采用SmartChip Real-Time PCR Systems(WaferGen Inc.，美国)高通量荧光定量反应平台.研究中所采用的293对引物在先前的相关的研究中被有效验证过[1].此外另外添加了1对用于检定超级细菌抗生素抗性基因blaNDM-1的引物[20]，1对intI 1 整合子基因(class1 integron)引物[21]和1对CintI 1临床医学意义上的整合子基因(clinical class 1 integon)引物[22].

　　PCR扩增反应的体积为100 nL.反应体系中各试剂的终浓度为： 1×的LightCycler 480 SYBR® Green ⅠMaster Mix(Roche，美国), nuclease-free PCR-grade water，1 ng ·μL-1的BSA，5 ng ·μL-1的DNA模板，1 μmol ·L-1的上下游引物. PCR反应条件为： 95℃预变性10 min;95℃变性30 s，60℃退火延伸30 s，总共40个循环;仪器程序自动升温进行熔解曲线分析.高通量定量PCR每个芯片都有不添加DNA模板的阴性对照. qPCR反应得到的数据通过Cycler预设定的筛选条件(扩增效率介于1.8~2.2)进行导出.根据SmartChip Real-Time PCR Systems的灵敏度和精确度，确定循环次数CT值为31时作为仪器的检测限.每个样品都进行3次技术重复实验，当3次技术重复都被扩增出来时认为是阳性扩增，3个采样平行样品都是阳性扩增时，认为样品的目的基因被有效检出.

　　1.4 数据分析

　　基因的相对拷贝数(gene relative copy number)参照Looft等[23]的研究，用公式(1)进行估算.根据Schmittgen等[24]关于相对定量分析方法，用FC(fold change)值，采用公式(2)来计算表征相对于城市生活污水对照样品，生活垃圾渗滤液的抗生素抗性的富集或者衰减状况.

　　(1)

　　(2)

　　式中，CT是PCR反应收集到特定荧光时的循环次数，ARG代表抗生素抗性基因，16S是代表 16SrDNA基因，Target是环境实验样品，Ref是对照样品，FC是ARGs拷贝数的富集或衰减程度.当FC=2[-(ΔΔCT+2 s)]>1时，且student t检验具有显著性时，认为环境实验样品相对于对照样品显著富集.

　　2 结果与讨论 2.1 城市生活污水和垃圾渗滤液中抗生素抗性基因的多样性

　　根据实验中使用的296对引物，按照基因对应抗生素类型分为氨基糖苷类抗生素(Aminoglycoside)、 β-内酰胺类抗生素(β-Lactamase)、氯霉素类抗生素(Chloramphenicol)、大环内脂类-林肯酰胺类-链阳性菌素B类抗生素(MLSB)、磺胺类抗生素(Sulfonamide)、四环素类抗生素(Tetracycline)、万古霉素类抗生素(Vancomycin)和其他类或者发挥外排泵作用(other/efflux)这8类抗生素抗性基因.城市生活污水(RWW)检测出187抗生素抗性基因，垃圾渗滤液检测出39中抗生素抗性基因(图 1).其中，城市生活污水检测到的抗生素抗性基因涵盖了以上全部8类抗生素类型，而垃圾渗滤液检测到的抗性基因类型只含有氨基糖苷类抗生素(Aminoglycoside)、大环内脂类-林肯酰胺类-链阳性菌素B类抗生素(MLSB)、四环素类抗生素(Tetracycline)和其它类或者发挥外排泵作用(other/efflux)这4类抗生素抗性类型.有研究表明，垃圾渗滤液中四环素类抗生素类型在中国6个不同地理位置的垃圾填埋场渗滤液中被有效检出[25, 26]，与本研究结果一致.此外，垃圾渗滤液检测到的4类抗生素抗性类型中的抗性基因数目均小于生活污水中的对应类型抗性基因数目.抗生素抗性基因按照抗性机制可以分成抗生素失活(deactivation)、外排泵作用机制(efflux)、核糖体保护机制(protection)和未知抗性机制(unkown)四大类.将检测到的抗生素抗性基因从抗生素抗性机制归类分析，抗生素失活(deactivation)是两种污水微生物抗生素抗性最主要机制，比例分别为48.13%和51.28%(图 2).垃圾渗滤液检测到的39种抗生素抗性基因中只有erm(35)基因仅在垃圾渗滤液中检出，其余38种抗性基因在城市生活污水同时被有效检出.总体结果表明，城市生活污水和垃圾渗滤液检测到的抗生素抗性种类有显著差异(P < 0.05).

　　图 1 检测到的抗生素抗性基因种类数

　　图 2 抗生素抗性机制的相对比例

　　2.2 抗生素抗性基因在城市生活污水和垃圾渗滤液中的污染分布格局

　　主成分分析表明，城市生活污水和垃圾渗滤液抗生素抗性基因结构不同，PCA1解释了抗性基因结构变化的98.8%，城市生活污水和垃圾渗滤液抗性基因沿第一轴分为两个簇，表明抗生素抗性基因在两种城市污水有着不同的分布格局(图 3).城市生活污水抗生素抗性基因分布相较于垃圾渗滤液更具有一致性.

　　图 3 城市生活污水和垃圾渗滤液抗生素抗性基因多样性主成分分析

　　Auerbach等[27]的研究表明，城市生活污水(污水处理厂进水)四环素类抗生素抗性基因的丰度高达109 copies ·L-1数量级.相较于垃圾渗滤液，热图分析表明(图 4)，城市生活污水的抗生素抗性基因丰度和多样性均显著大于垃圾渗滤液(P < 0.05). 图 4中A簇代表抗生素抗性基因在城市生活污水和垃圾渗滤液中均有检出，主要类型是氨基糖苷类和四环素类抗生素抗性基因，并且A1簇的抗生素抗性相对于A2簇显著富集. B簇和C簇中的抗生素抗性基因仅在城市污水中检出，垃圾渗滤液中未检出(D簇)，并且抗生素抗性潜在表达强度B簇大于C簇.垃圾渗滤液是垃圾填埋体产生的“二次污染物”[28]，运营时间5 a以上的垃圾填埋场产生的垃圾渗滤液含有多种有毒有害物质，并且氨氮浓度高，可生化性差[13]，高通量定量PCR结果表明垃圾渗滤液抗生素抗性类型和抗性基因丰度低于城市生活污水，热图分析总体结果显示，城市生活污水和生活垃圾渗滤液抗性基因污染分布格局显著不同.

　　图 4 城市生活污水和垃圾渗滤液抗生素抗性基因污染分布格局

　　2.3 抗生素抗性基因丰度与城市生活污水抗性基因的富集

　　广州、福州等地的污水厂接纳当地生活垃圾填埋场垃圾渗滤液进行合并处理，普通生活污水处理厂承担部分垃圾渗滤液的处理任务已经成为垃圾渗滤液处理的“新常态”，实践证明是一种经济有效的方式[13, 17].本研究中采集的城市生活污水样品中含有一定量的垃圾渗滤液(浓缩液)，因此可以将垃圾渗滤液作为对照样品，研究抗生素抗性基因的在这两种城市污水的异同.根据Schmittgen等[24]关于基因拷贝数(gene copy number)的计算(估算)方法，得到了抗生素抗性基因的基因拷贝数(图 5).抗生素抗性基因在城市生活污水抗性基因拷贝数最高是others类(包含多重耐药基因、转座子基因、整合子基因等)抗性基因，除此之外，氨基糖苷类抗生素和四环素类的抗性基因的基因拷贝数分别达到了1.4×108 copies ·L-1、 3.6×107 copies ·L-1.垃圾渗滤液中检测到的39种抗性基因，分为4大类，基因拷贝数最高的是氨基糖苷类抗生素抗性基因，达到1.1×105 copies ·L-1，显著低于生活污水中的抗性基因丰度(P < 0.05).

　　图 5 城市生活污水和垃圾渗滤液抗生素抗性基因丰度

　　城市生活污水氮磷等营养元素丰富，相对于垃圾渗滤液其有毒有害物质浓度较低，微生物数量多，世代更新快，并且微生物种类繁多等特性，两者合并处理有一定优势[13].城市生活污水检出富集的抗性基因总共有7大类，其中119种抗生素抗性基因和可移动元件显著增加(P < 0.05)，富集倍数前三的基因是转座子tnpA-04基因、 blaVEB和blaOXA10-01，分别达到了3 338、 1 061和1 001倍(图 6)，表明转座子基因和β-内酰胺类抗生素抗性基因在城市生活污水中显著富集.环境抗生素抗性基因在微生物中存在着水平基因转移机制(horizontal gene transfer，HGT)，可移动元件(MGEs)与总抗生素抗性存在线性相关[7]，可能是污水厂的进水普遍有较高的检出率和富集现象的原因之一.抗生素残留和重金属离子对抗生素抗性具有共选择或者诱导作用，导致了特定类型的抗生素抗性基因的出现和富集[10, 29].城市生活污水和垃圾渗滤液都是人类生产生活末端的“副产物”，含有一定量的抗生素残留和重金属离子，在分子机制上进一步研究它们与抗生素抗性基因的关系，分析抗性基因在环境物质胁迫下的演变传播显得十分必要.

　　图 6 城市生活污水富集的抗生素抗性基因

　　虽然Wang等[25]和Wu等[26]的研究表明垃圾渗滤液可以检测出四环素类和磺胺类等少量几种抗生素抗性基因，但是本研究的结果表明垃圾渗滤液抗性基因丰度并不高，垃圾渗滤液可以跟城市生活污水合并处理，但是还需考虑高浓度抗生素残留和重金属等可能促进城市生活污水抗生素抗性的潜在影响.此外，城市生活污水中高丰度和多类型的抗生素抗性基因对于人工湿地处理生活污水等处理方式可能潜在的生态环境安全风险也提供了新的考量和评价视角.

　　3 结论

　　(1) 垃圾渗滤液抗生素抗性基因丰度不高，可以接入城市生活污水厂合并处理，城市生活污水是环境抗生素抗性的一个重要存储库.

　　(2) 抗生素抗性基因在城市生活污水和生活垃圾渗滤液中既有区别又有联系，有着显著不同的分布格局.(来源及作者：中国科学院城市环境研究所城市环境与健康重点实验室 黄福义、李虎、安新丽、欧阳纬莹、苏建强)