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低DO下AGS-SBR处理生活污水长期运行特征好氧颗粒污泥具有沉降性能好、 污泥浓度高，易于固液分离，便于提高污水处理效率，降低污水处理成本等优点[1]而备受关注. 由于其特殊的颗粒球状结构导致了污泥内外形成溶解氧(DO)浓度差，这便为好氧颗粒污泥工艺能够实现同步去除COD、 氮和磷提供了合适的条件[2]. 据报道，DO是影响污水生物脱氮除磷的影响的关键因素之一[3]，过低的DO会影响其硝化速率，易导致亚硝态氮积累，从而影响系统除磷效果; 而过高的DO又会致使反应器出水硝态氮含量过高，并且能耗较大[4]. 虽然低DO有利于污泥系统同步硝化反硝化的形成[2]，但是关于低DO下，好氧颗粒污泥(AGS)系统处理生活污水同步脱氮除磷的长期运行特征至今报道不多; 关于好氧颗粒污泥中的生物种群构成，尤其是处理低COD/N比生活污水好氧颗粒系统中生物种群结构分析，更是鲜见报道. 一些研究学者采用原位荧光杂交技术(FISH)研究污水处理系统中脱氮除磷菌群的构成[5, 6]; 还有学者采用聚合酶链式反应和变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)分析反应器中的生物种群的演变特征及主要菌群[7]等. 然而，以前的研究由于缺乏高通量技术分析结果，其结果仅限于氨氧化细菌(AOB)和亚硝化细菌(NOB)等个别菌群的分析，而缺乏相对完整的颗粒污泥系统生物种群构成信息. 了解生物反应器内主要功能菌群的构成有利于了解生化反应和工艺调控[8]. 近年来具有低成本、 高通量、 自动化程度高等特点的高通量测序技术逐渐发展起来，该技术能一次对多达几百万条DNA分子进行序列测定，同时也可以对一个物种的转录组和基因组进行细致的分析[9]. 并且该技术已经开始在污水处理系统中用于种群结构分析[10]. 因此，本实验在序批式活性污泥反应器中(SBR)接种好氧颗粒污泥(AGS)，构建成AGS-SBR系统，主要研究该系统在低DO下，处理低COD/N比生活污水的同步脱氮除磷的长期稳定运行特性，并采用高通量测序技术解析稳定运行期间的主要菌群构成，以期为该工艺应用于处理低COD/N比生活污水的实际工程及工艺调控提供可靠的实验依据.1 材料与方法1.1 实验装置与运行方式 实验装置采用序批式活性污泥反应器(SBR)如图 1所示. 反应器由有机玻璃制成，高20 cm，长10 cm，有效容积为1.5 L. 反应器上部和下部设置了排水口和取样口，采用空气压力机通过底部的沙盘曝气头进行曝气，转子流量计控制气体流量. 将反应器置于恒温水浴锅中，使其反应温度保持在30℃左右. 反应器每天运行两个周期，每个周期720 min： 进水5 min、 曝气360 min、 沉淀5 min、 排水5 min、 余下345 min为闲置. 每周期排水为反应器有效容积的50%. 通过转子流量计控制反应器的曝气量，从而控制溶解氧(DO)浓度为0.5-1.0mg ·L-1. 根据实际情况进行排泥，使反应器内污泥龄约为20 d.  图 1 SBR实验装置示意 1.2 接种污泥和实验用水 接种污泥为本课题组前期同步脱氮除磷工艺成功启动后60 d的好氧颗粒污泥，其直径大约为0.6-1.5 mm，颜色为黄色，污泥体积指数SVI=55.22 mL ·g-1,实验用水为人工配制的模拟生活污水[11]. 葡萄糖、 柠檬酸三钠为碳源，(NH4)2SO4为氮源，KH2PO4为磷源，反应器启动运行期，加入40 mg ·L-1 Ca2+以及微量Fe2+、 Cu2+等离子，NaHCO3调节pH至7.5-8.0，主要水质指标ρ(COD)为200-300mg ·L-1， ρ(TN)为50-60mg ·L-1，ρ(TP)为2-3.5mg ·L-1. 1.3 实验分析方法1.3.1 污泥样品采集及测序实验流程 取自AGS-SBR稳定运行期的污泥样品，首先，采用淤泥基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型)，根据说明书提取样品DNA，并将DNA提取物放在-20℃条件下保存. 然后，对16S rRNA的V3、 V4区域进行PCR扩增，引物338F： 5′-ACTC CTACGGGAGGCAGCA-3′，806R： 5′-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3′. PCR条件： 95℃预变性2 min，然后执行95℃变性30 s、 55℃退火 30 s、 72℃ 延伸30 s，共30个循环，最后再72℃退火5 min，扩增产物保持在4℃条件下. 样本按照正式实验条件进行，样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖电泳检测，采用 AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测; 然后，参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，取合适的浓度进行EmPCR(平行扩增)，用Illumina Miseq系统测序(上海美吉生物医药科技有限公司). 所得结果进行过滤处理，得到优化序列; 对优化序列在97%相似度水平进行OTU 聚类分析和物种分类学分析，分析样品的多样性以及群落结构[10, 12]. 1.3.2 水质和污泥指标分析 实验期间，水体COD、 NH4+-N、 TN、 NO3--N、 NO2--N和TP以及污泥MLSS、 SVI指标均按国标法测定[13]; 污泥形态观察、 DO、 pH值测定均按照参考文献[11]进行. 2 结果与分析 2.1 AGS-SBR除污性能的长期稳定运行特征 在AGS-SBR反应器稳定运行的180d里，反应器对污水COD、 氨氮、 TN、 TP的去除情况以及出水NO3--N和NO2--N的浓度情况如图 2所示. 进水COD浓度在178.56-267.51 mg ·L-1之间波动，出水COD浓度为14.97-46.08 mg ·L-1，平均出水浓度为29.08 mg ·L-1. 整个运行期间，反应器对COD的去除效果始终保持较高的水平，平均去除率为87.17%[图 2(a)]. 反应器对NH4+-N的去除情况如图 2(b)所示，进水的NH4+-N浓度波动较大，为49.52-70.12 mg ·L-1，平均进水浓度为59.43 mg ·L-1. 运行期间，由于转子流量计的不稳定，使得反应器内的DO浓度有一定的波动，因此导致了出水NH4+-N浓度及其去除率稍微有一些波动，整个反应器运行期间，出水NH4+-N浓度最高达7.21 mg ·L-1，但其平均出水浓度为2.83 mg ·L-1，平均去除率为95.21%. 同时，反应器运行过程中，出水NO3--N、 NO2--N的积累情况见图 2(c). 虽然实验过程中，由于转子流量计的不稳定，导致反应器内曝气量的略有波动，使得出水NO3--N和NO2--N的浓度有一些小的变化，但通过及时对流量计进行微调，控制反应器内DO浓度的稳定，整个反应器运行期间，反应器出水NO3--N和NO2--N的浓度不高，平均浓度分别为3.48mg ·L-1和3.24mg ·L-1. 反应器对污水中的TN和TP的去除效果呈逐步稳定趋势[图 2(d)和图 2(e)]. 反应器平均进水TN浓度为60.12 mg ·L-1，平均出水浓度为13.26mg ·L-1，平均去除率为77.05% [图 2(d)]. 而进水TP浓度在2.03-3.62 mg ·L-1内波动，平均进水浓度为2.98 mg ·L-1，但出水一直保持稳定. 运行过程中，曝气量的波动对反应器内的除磷菌的活性没有影响，因此反应器内的除磷效果始终保持在较为稳定的状态，TP最高出水浓度为0.44 mg ·L-1，平均出水浓度为0.26 mg ·L-1，平均去除率为91.11% [图 2(e)]. 本实验的研究表明，对于AGS-SBR同步脱氮除磷工艺来讲，在工程应用上要严格控制曝气量，使DO浓度在0.5-1.0mg ·L-1之间，可保证反应器内微生物对氮素和TP的最高去除能力. AGS-SBR系统内，好氧颗粒污泥自身的特殊结构，以及低DO的运行方式，使得反应器内同时存在着好氧菌和厌氧菌，为TN和TP的去除起到了良好的促进作用.  图 2 AGS-SBR反应器对COD、 氨氮、 TN和TP的去除情况及出水NO3--N和NO2--N的变化 2.2 AGS-SBR污泥性能变化分析 AGS-SBR反应器内MLSS及污泥体积指数(SVI)的变化如图 3所示. 反应器启动初期接种的好氧颗粒污泥MLSS和SVI分别为3.02 g ·L-1和49.52 mL ·g-1，在以后稳定运行的180d里，污泥的MLSS和SVI值虽有一定的波动，但是变化不是很明显，其MLSS和SVI值平均分别为3.24 g ·L-1和41.32 mL ·g-1，较反应器启动初期接种的好氧颗粒污泥，反应器污泥浓度MLSS略有增加，而SVI值略有减少. 表明反应器运行整个期间，AGS-SBR系统内的好氧颗粒污泥沉降性能一直很好，表现出良好的稳定性. 同时，对第0、 40、 60、 100、 140和180 d的反应器中好氧颗粒污泥形态进行观察，如图 4所示. 颗粒污泥在整个运行期间，其外观没有明显变化，6个不同运行时间的颗粒污泥均呈现出外形规则、 边缘较平整，颗粒结构紧密等特征，并没有出现明显的颗粒污泥解体的现象. de Kreuk等[14]曾报道当DO小于3.0-4.0 mg ·L-1，能引起颗粒污泥的解体. 和以前的研究报道相比[15]，本实验中，低DO条件下，AGS-SBR系统表现出良好的脱氮除磷及颗粒污泥稳定性. 原因在于，本研究反应器进水属于低基质生活污水，有利于生长速率较慢的硝化细菌、 聚磷菌PAOs的富集[16]，从而导致颗粒污泥生长速率变慢，MLSS增长较低. 本实验中，即使是在较低DO下(0.5-1.0mg ·L-1)，AGS-SBR系统中好氧颗粒污泥运行180 d后仍然保持良好的完整性和沉降性能. 同时，本研究中，处理低碳氮比生活污水的AGS-SBR系统所需要的DO浓度比其他的AGS-SBR污水处理系统大约低60%～70%[17]. 可见，AGS-SBR是一种低能耗、 无需外加碳源、 高效处理低COD/N比生活污水的脱氮除磷工艺.  图 3 运行阶段反应器中颗粒污泥MLSS与SVI的变化情况  图 4 运行阶段颗粒污泥的形态变化 2.3 AGS-SBR的主要菌群 本研究中，AGS-SBR系统对污水TN 和 TP的平均去除率分别达到77.05%和91.11%，污水处理系统表现出的除污性能主要和系统内优势微生物菌群的构成密切相关. 为了进一步深入了解低DO下，好氧颗粒污泥工艺表现出良好的脱氮除磷效果的微生物学机理，因此对AGS-SBR反应器内稳定期间的微生物菌群进行解析. AGS-SBR系统中好氧颗粒污泥中的细菌种群构成如图 5所示(门水平). 污泥的主要菌群为：变形菌门(Proteobacteria，相对丰度为66.91%)、 厚壁菌门(Firmicutes，相对丰度为21.64%)、 绿菌门(Chlorobi，相对丰度为2.65%)、 绿弯菌门(Chloroflexi，相对丰度为2.09%)、 拟杆菌门(Bacteroidetes，相对丰度为1.85%)、 放线菌门(Actinobacteria，相对丰度为0.7%)和浮霉菌门(Planctomycetes，相对丰度为0.13%). 其中变形菌门菌群所占比重最大，其次是厚壁菌门(Firmicutes)，再者是绿菌门(Chlorobi)、 绿弯菌门(Chloroflexi)和拟杆菌门(Bacteroidetes)等. 同时，表 1列出了反应器稳定运行期颗粒污泥样品属水平上，被鉴定出的氨氧化菌(AOB)、 亚硝酸氧化菌(NOB)、 反硝化菌和除磷菌.  图 5 污泥样品微生物菌群的相对丰度(门水平)  表 1 属水平上，被鉴定出的氨氧化菌(AOB)、 亚硝酸氧化菌(NOB)、 反硝化菌和除磷菌及其丰度 2.4 AGS-SBR脱氮除磷机制讨论 有研究报道，变形菌门菌群(Proteobacteria)是城镇污水处理厂活性污泥系统和废水生物反应系统的主要种群，包含多种代谢种类，在降解有机物的同时完成脱氮除磷的功能[18]. 厚壁菌门(Firmicutes)中的芽孢杆菌纲(Clostridia)可能与COD及难以分解的大分子有机物的降解有关[19]. 绿弯菌门(Chloroflexi)常存在于污泥菌胶团絮状体内部，并以絮体骨架的形式存在，这为好氧颗粒污泥的结构提供了骨架支撑[20]. Kragelund等[21]在对活性污泥中绿弯菌门(Chloroflexi)的种类、 丰度和生态生理学的研究中也发现，绿弯菌门(Chloroflexi)具有较好的生物除磷作用. Hill等[22]发现拟杆菌门(Bacteroidetes)具有非常强的营养物质代谢能力，如复杂有机物、 蛋白质和脂类等. Li等[23]在污水处理系统剩余污泥减量化及微生物菌群演变的研究中发现，拟杆菌门(Bacteroidetes)具有水解污泥絮体的作用. 本研究中，上述生物种群构成了AGS-SBR系统好氧颗粒污泥的主要生物种群，它们对废水中的COD、 氨氮、 TN和TP的去除起着重要作用，这和反应器表现出良好的同步脱氮除磷性能密切相关. 另外，本研究中，颗粒污泥样品中也检测到了少量的浮霉菌门(Planctomycetes). 在浮霉菌门(Planctomycetes)存有一些菌属具有厌氧氨氧化功能[24]，但环境中仍存在未鉴定的新菌种. 该类菌群能在厌氧的条件下，以NH4+-N、 NO2--N分别为电子供体和受体，反应生成气态氮，从而达到生物脱氮的目的. 本实验中，由于进水COD/N比较低，并且反应器在较低DO条件下运行，检测出来的浮霉菌门(Planctomycetes)种群中有可能存在着厌氧氨氧化功能的菌群. 再者，通过对反应器内主要脱氮除磷功能菌群的分析(表 1)可以看出，颗粒污泥样品中梭菌属(Clostridium)相对丰度最高，高达21.24%. 曾有文献报道，Clostridium是一类具有反硝化除磷功能的菌群[25]. 黄荣新等[26]在SBR反应器中进行反硝化聚磷菌(DPB)强化富集，也分离得到了高效反硝化除磷菌属Clostridium. 这类反硝化聚磷菌(DPB)，可以在缺氧环境下以NOx-为电子受体，利用内碳源，通过“一碳两用”方式实现反硝化脱氮的同时过量聚磷. 目前报道最多的聚磷菌(PAOs)按其菌属可划分为不动杆菌属(Acinetobacter)、 气单胞菌属(Aeromonas)、 棒杆菌属 (Corynebacterium)、 肠球菌属 (Enterococcus)等[27]. 但是本实验结果中并没有监测出已经报道的这四类聚磷菌. 而是检测出具有反硝化除磷功能的一类菌群梭菌属(Clostridium). 同时，反应器中存在厌氧绳菌属(Anaerolinea)细菌，属于绿弯菌门(Chloroflexi)中的一类，是和除磷性能有关的一类菌群[21]. 同时，AGS-SBR反应器内存在着多种与脱氮有关的菌群. Denitratisoma是红环菌科(Rhodocyclaceae)的一个新属，是Fahrbach等[28]从城市污水处理厂的活性污泥中分离得到的，是一类新型的具有好氧反硝化能力的菌群，能直接将亚硝态氮转化为气态氮[8]; 陶厄氏菌属(Thauera)是近年来才被定义的一个属，广泛分布于污水处理系统中，在污水处理系统、 污泥和土壤环境中生长良好[29]，大都为杆状且具有好氧反硝化能力[30]. 此外，反应系统中存在少量的毛球菌属(Comamonas)和亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)，这些菌群是和好氧反硝化能力有关的脱氮菌群[31]. 由于AGS-SBR系统长期在低DO条件下进行，反应器中存在着好氧、 缺氧和厌氧的微环境，反应器内可能存在自养反硝化、 好氧反硝化、 厌氧氨氧化等多种脱氮途径. 但从表 1可知，Denitratisoma的相对丰度较高，表明反应器内以好氧反硝化为主的方式进行脱氮; 而氨氧化菌(AOB)、 亚硝酸氧化菌(NOB)和Planctomycetaceae等含量较低，说明反应器中存在自养反硝化、 短程脱氮、 厌氧氨氧化等多种脱氮途径，但不在反应器中占据主导地位. 综上，从实验结果分析初步判断，低DO条件，AGS-SBR反应器中Clostridium、 Anaerolinea 和Denitratisoma相对丰度较高，导致了反应系统具有良好的脱氮除磷性能. 3 结论 (1)在反应器运行的180 d里，AGS-SBR系统表现出了良好的稳定运行特征，对COD、 NH4+-N、 TN和TP的平均去除率分别为87.17%、 95.21%、 77.05% 和91.11%，平均出水浓度稳定在29.08、 2.83、 13.26和0.26mg ·L-1; NO--N和NO3--N的平均积累量分别为3.48mg ·L-1和3.24mg ·L-1. (2) AGS-SBR反应器运行期间，系统平均污泥浓度MLSS为3.24 g ·L-1，SVI值平均为41.32 mL ·g-1，好氧颗粒污泥始终保持着完整的外观和密实紧凑的结构，并没有出现明显的颗粒污泥解体的现象. AGS-SBR系统是一种低能耗、 无需外加碳源、 高效处理低COD/N比生活污水的脱氮除磷工艺. (3) 高通量测序结果表明，变形菌门(Proteobacteria)、 厚壁菌门(Firmicutes)、 绿菌门(Chlorobi)、 绿弯菌门(Chloroflexi)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为SBR-AGS反应器中主要优势菌群. 好氧颗粒污泥中，Denitratisoma、 Planctomycetaceae、 Thauera、 Comamonas、 Nitrosomonas和Nitrospira是反应器中与脱氮有关菌群，而Clostridium和 Anaerolinea 是和除磷相关的菌群. |
