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放射性废水处理中吸附铀的优势藻种筛选铀是一种具有放射性和高毒性的重金属元素，对生态环境和人体健康存在极大威胁. 在核工业生产(如核电站)的各个环节及核事故中，均会产生一定量的含铀放射性废水[1]. 因此，需要对含铀放射性废水进行妥善处理与处置. 传统的放射性废水处理技术大多采用物理法或物理化学法. 用于处理低、 中放射性废水的技术主要包括化学沉淀、 蒸发、 离子交换和膜分离(低放废水)等[2]. 虽然传统的放射性废水处理技术在大部分情况下对放射性核素的去除效率较高，并且技术发展较为成熟，但仍存在处理低浓度废水时效率较低[3]、 药剂消耗大(化学沉淀)、 能耗高(蒸发)、 易腐蚀与结垢(蒸发)、 易产生二次污染[4]等局限性. 除上述传统技术外，吸附技术因操作简单和处理效率高等优点，在放射性废水处理领域研究较多[5]，尤其生物吸附技术更是引起了广泛关注[6, 7, 8]. 许多微生物如细菌、 放线菌、 真菌和微藻等，均可作为生物吸附剂[9, 10, 11, 12, 13, 14]. 其中，利用微藻作为吸附剂具有独特的技术优势：易于培养，可利用太阳光将CO2直接转化为生物质，甚至可以在经过预处理的生活污水中生长[15, 16]; 藻细胞易于分离收获; 能耗低; 无二次污染，环境生态友好; 有可能对有价值的重金属进行回收[6, 17, 18, 19, 20]. 因此，利用微藻作为生物吸附剂处理含铀放射性废水，已成为近年来放射性废水处理领域的研究热点. 获得吸附铀的优势藻种是研究和应用微藻生物吸附技术的前提和基础. 从实际工程应用的角度出发，优势藻种的筛选原则应综合考虑多种因素. (1)吸附容量大 单位藻细胞生物质对铀元素的吸附量尽可能大，从而减少微藻吸附剂的投加量，同时提高含铀放射性废水的处理效率. (2)培养成本低 微藻培养的成本较高，限制了其在污水处理和生物能源生产等领域的工程化应用. 微藻生长对水和氮磷无机盐的大量消耗是造成其高培养成本的首要因素[21]. 若藻种能在生活污水一级、 二级处理出水中生长，则可充分利用其中的水和氮磷资源，从而降低培养成本. (3)生物质产量高 藻种可在生活污水二级处理出水等低氮磷水体中生长，且生物质产量高. (4)沉降性能好 藻种在培养进入稳定期后，藻细胞沉降速率快，以利于分离收获. 本研究以上述筛选原则为基础，选择了11株备选藻种进行吸附铀的优势藻种筛选工作，以期为后续研究提供材料基础. 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 藻种 备选藻种共计11株，包括8株实验室分离藻种和3株购买藻种. 在8株实验室分离藻种中，栅藻LX1(Scenedesmus sp. LX1)由长期储存的自来水中分离获得; 小球藻ZTY1(Chlorella sp. ZTY1)、 小球藻ZTY2(Chlorella sp. ZTY2)、 斜生栅藻ZTY(Scenedesmus obliquus ZTY)和椭圆栅藻ZTY(Scenedesmus ovalternus ZTY)由城镇生活污水一级出水中分离获得; 栅藻ZSF1(Scenedesmus sp. ZSF1)、 栅藻ZSF2(Scenedesmus sp. ZSF2)和羊角月牙藻ZSF(Selenastrum sp. ZSF)由以再生水为补充水源的景观水体(北京高碑店湖)中分离获得. 由上述8株藻种的分离环境可以看出，本研究旨在获得1株既对铀有良好的吸附性能、 又可在低氮磷水体(以城镇生活污水处理出水为代表)中生长的优势藻种，以降低工程化应用时的藻细胞培养成本. 其余3株藻种均购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库. 11株备选藻种的具体情况如表 1所示.  表 1 11株备选藻种 1.1.2 藻细胞培养基 采用低氮磷水平的mBG11培养基，模拟城镇污水处理厂污染物排放一级A标准的氮磷浓度限值(TN为15 mg ·L-1，TP为1.5 mg ·L-1). 成分组成为：NaNO3 91.1 mg ·L-1、 K2HPO4 ·3H2O 11 mg ·L-1，其余组分同稀释50%的BG11培养基，包括MgSO4 ·7H2O 37.5 mg ·L-1、 CaCl2 ·2H2O 18 mg ·L-1、 柠檬酸3 mg ·L-1、 柠檬酸亚铁铵3 mg ·L-1、 EDTA(乙二胺四乙酸)0.5 mg ·L-1、 Na2CO3 10 mg ·L-1、 A5+Co溶液1.0 mL ·L-1. A5+Co溶液的组成为：H3BO3 2.86 g ·L-1、 MnCl2 ·4H2O 1.81 g ·L-1、 ZnSO4 ·7H2O 222 mg ·L-1、 CuSO4 ·5H2O 79 mg ·L-1、 Na2MoO4 ·2H2O 390 mg ·L-1、 Co(NO3)2 ·6H2O 49 mg ·L-1. 1.1.3 主要仪器设备 人工光照培养箱(HPG-280H)、 高温灭菌锅(SANYO MLS-3750)、 离心机(HITACHI CF 16RXⅡ)、 超净工作台(AIRTECH VS-1300L-U)、 恒温水浴锅(ANPEL DC-12H)、 精密电子分析天平(岛津AUY220)、 冷冻干燥机(FDU-1100)、 pH计(Sartorius PB-10)、 双功能水浴恒温振荡器(SHA-B)、 紫外可见分光光度计(UV-2401PC). 1.2 方法 1.2.1 藻细胞培养 向500 mL锥形瓶中加入200 mL mBG11培养基，高温高压灭菌(121℃，30 min,除特别指出，所有水样在微藻培养前均经过高温高压灭菌处理)，取5 mL藻种液接种至上述培养基中，放入光照培养箱中培养. 培养条件：光照强度56 μmol ·(m2 ·s)-1，光暗比14 h ∶10 h，温度25℃. 1.2.2 藻种分离 藻种分离的方法为平板划线法. 向50 mL mBG11液体培养基中接种藻种，培养3-4 d后，将藻种液分别稀释1、 2、 5、 10和20倍，然后划线涂在mBG11固体培养基(琼脂含量2.5%)平板上，再置于光照培养箱中培养，培养条件同1.2.1节. 待固体平板上长出单个藻落后，挑取单个藻落再次进行划线分离和培养. 反复3次后得到纯藻种. 1.2.3 藻细胞干重测定 将孔径为0.45 μm的滤膜浸泡在高纯水中并煮沸，重复3次以除去滤膜中的杂质. 将煮后的滤膜在105℃烘箱中烘干24 h，在干燥器中晾至室温后用千分之一天平称取其重量. 取适量藻液用上述滤膜过滤，将截留藻细胞的滤膜在105℃烘箱中烘干24 h，在干燥器中晾至室温后用千分之一天平称取其重量. 前后两次测得的滤膜质量差即为藻细胞干重. 1.2.4 藻细胞沉降性测定 待藻细胞生长进入稳定期后，测量藻细胞干重. 在室温下取200 mL摇匀藻液，置于Imhoff沉降管中静置沉降60 min，将上清液(180 mL)倒出，利用滤膜法测量底部20 mL浓藻液的藻细胞干重，再根据式(1)计算沉降率S.  式中，S：表征藻液中可沉降部分占总生物质的比例，%; Xm：原藻液的藻干重，g ·L-1; m：Imhoff沉降管底部20 mL浓缩藻液的藻干重，g ·L-1. 沉降率S的值越大，表明藻细胞的沉降性越好. 1.2.5 溶液中 U(Ⅵ)含量的测定 溶液中 U(Ⅵ)含量的测定采用5-Br-PADAP分光光度法，具体测定步骤如下. (1)配制试剂 ① 混合掩蔽剂溶液：称取12 g环己二胺四乙酸(CyDTA)，溶于150 g ·L-1的氢氧化钠溶液，加入3 g氟化钠、 32 g磺基水杨酸和400 mL水. 待全部溶解后，调节溶液 pH 至8，然后加水稀释至500 mL. ② 酚酞指示剂：0.1 g ·L-1乙醇溶液. ③ 三乙醇胺缓冲溶液：取100 mL三乙醇胺溶于300 mL水中，调节溶液pH至8，再加水稀释至500 mL，混匀. ④ 丙酮：纯丙酮试剂. ⑤ 显色剂Br-PADAP乙醇溶液：称取0.25 g Br-PADAP溶于500 mL无水乙醇溶液. (2)绘制标准曲线 取6个50 mL容量瓶，分别加入含有0、 10、 20、 30、 40、 50 μg铀的标准溶液[硝酸双氧铀，UO2(NO3)2 ·6H2O]; 加入5 mL混合掩蔽剂溶液和1滴酚酞指示剂; 先用400 g ·L-1的氢氧化钠溶液调至粉红色，再用1 mol ·L-1的盐酸调至无色; 加入3 mL三乙醇胺缓冲溶液、 10 mL丙酮和3 mL显色剂Br-PADAP乙醇溶液; 用水稀释至刻度，摇匀. 放置30-60 min后，以空白溶液为参比，测定铀标准溶液在580 nm下的吸光度值D580，并建立D580与铀质量(μg)关系的标准曲线，如图 1所示.  图 1 铀标准溶液在580 nm下的吸光度D580和U(Ⅵ)质量的关系曲线 1.2.6 藻细胞对铀的吸附容量测定[22] 待藻细胞在mBG11培养基中生长进入稳定期后，对藻细胞进行离心收获、 冷冻干燥、 研磨，制成藻干粉. 用移液管量取50 mL已知质量浓度的铀溶液至100 mL带塞锥形瓶中，用 0.1 mol ·L-1的盐酸和NaOH溶液调节pH值至4，加入一定量的藻粉，置于30℃水浴恒温振荡器中振荡60 min. 吸附过程结束后，取一定量混合液离心(10 000 r ·min-1，10 min，4℃)，取上清液用5-Br-PADAP分光光度法测定其吸光度D580，并根据吸光度D580和U(Ⅵ)质量的关系曲线计算上清液中的铀离子含量. 藻细胞对铀离子的吸附容量qt (mg ·g-1)可通过式(2)计算：  式中，qt：藻细胞对铀离子的吸附容量，mg ·g-1; c0：铀溶液的初始浓度，mg ·L-1; ct：上清液中的铀浓度，mg ·L-1; V：铀溶液的体积，L; m：加入藻粉的质量，g. 1.2.7 试验数据处理 每组试验均做3个平行样，并对试验数据进行误差分析. 2 结果与分析 2.1 不同藻种对铀的吸附容量比较 藻细胞对铀的吸附容量是筛选优势藻种需要考虑的首要因素. 分别取11株备选藻种的25 mg藻干粉加入50 mL初始铀浓度为50 mg ·L-1的铀溶液中，在30℃水浴恒温下振荡60 min后，不同藻种对铀的吸附容量对比如图 2所示. 从中可见，在11株备选藻种中，栅藻LX1对铀的吸附容量最大，为40.7 mg ·g-1，其次是普通小球藻.  图 2 不同藻种对铀的吸附容量对比 2.2 不同藻种在mBG11培养基中的最大生物量比较 11株备选藻种在mBG11培养基中生长16 d、 进入稳定期后的最大生物量对比如图 3所示，可代表藻种在城镇生活污水二级处理出水中的最大生长潜力. 除月牙藻ZSF的最大生物量较低(仅0.16 g ·L-1)外，其余所有藻种的最大生物量均在0.27 g ·L-1以上，尤其是栅藻ZSF1、 小球藻ZTY2、 栅藻LX1等8株藻种的最大生物量达到了0.30-0.40 g ·L-1之间.  图 3 不同藻种在mBG11培养基中生长16 d后的最大生物量对比 在一般的微藻培养体系中，典型的藻细胞生物量水平[23]为0.30-0.40 g ·L-1. 可见，除月牙藻ZSF外，绝大部分藻种均在城镇生活污水二级处理出水中有较大的生长潜力. 其原因为，从污水处理厂或实际水体中分离得到的藻种，往往能够更好地适应实际水体环境，生长状况更好[24]. 2.3 不同藻种的沉降性能比较 沉降率S表征了藻液静置60 min后，易于自然沉降的藻细胞生物质占总生物质的比例. 重力沉降是最简单、 最常用的藻细胞收获方式之一，沉降率S越高，表明藻细胞越易于通过重力沉降收获. 11株备选藻种生长进入稳定期后的沉降率对比如图 4所示.  图 4 不同藻种生长进入稳定期后的沉降率对比 可见，雨生红球藻和所有栅藻的沉降率普遍较高，均在40.0%以上; 其中，栅藻ZSF1、 雨生红球藻和栅藻LX1的沉降率较高，分别为48.7%、 47.9%和45.3%. 小球藻的沉降率相对较低，均在30.0%左右. 羊角月牙藻的沉降率最低，仅为24.6%. 3 讨论 3.1 藻细胞对铀的吸附容量 Kalin等[25]总结了不同藻种对U(Ⅵ)的吸附能力，如表 2所示. 其中，Pseudomonas对铀的吸附容量最大，为96 000 mg ·g-1; 吸附容量在100-600 mg ·g-1之间的藻种有13株，占总数的56.5%; 吸附容量在100 mg ·g-1以下的藻种有9株，占总数的39.1%. 栅藻LX1对铀的吸附容量在表 2中属于后40%，与表中栅藻的吸附容量(75 mg ·g-1)同属一个数量级.   表 2 藻种对U(Ⅵ)的吸附容量对比 [25] 虽然栅藻LX1对铀的吸附容量与已有报道的藻种相比并不具有优势，但如前文的筛选原则所述，面向实际应用，不能仅关注吸附容量，还应综合考虑藻细胞培养成本、 藻细胞易培养性、 藻细胞沉降性能等多种因素. 3.2 吸附铀的优势藻种确定 藻种对铀的吸附容量及其在低氮磷水体(城镇生活污水处理厂二级处理出水)中的生长潜力，是藻种筛选的两项主要指标. 以不同藻种在mBG11培养基中的最大生物量为横坐标、 对铀的吸附容量为纵坐标，绘制优势藻种筛选图，如图 5所示.  图 5 吸附铀的优势藻种筛选对比 越靠近上方的点，表明藻种对铀的吸附容量越高; 越靠近右方的点，表明藻种在低氮磷水体中的生长潜力越大. 根据筛选原则，应选择右上方的点作为优势藻种. 通过图 5可以看出，栅藻LX1处于图中的右上方位置：其对铀的吸附容量最高，并且在低氮磷水体中的生长潜力也较大. 同时，栅藻LX1在生长进入稳定期后的沉降性能也较好. 因此，在本研究范围内，可确定栅藻LX1为放射性废水处理中吸附铀的优势藻种. 4 结论 (1)优势藻种应具备对铀的吸附容量大、 培养成本低(可在生活污水二级处理出水中生长)、 在低氮磷水体中的生物质产量高、 沉降性能好等特点. (2)栅藻LX1对铀的吸附容量最大，为40.7 mg ·g-1. (3)栅藻LX1在mBG11培养基(模拟城镇污水处理厂污染物排放一级A标准的氮磷浓度限值：TN 15 mg ·L-1，TP 1.5 mg ·L-1)中的生物质产量较高，为0.32 g ·L-1. (4)栅藻LX1在生长进入稳定期后的沉降性能较好，沉降率为45.3%. (5)综合考虑各项筛选原则，在本研究范围内，栅藻LX1为放射性废水处理中吸附铀的优势藻种. |
