|
污水中违禁药物分析方法优化违禁药物是对人类中枢神经系统具有强烈兴奋或抑制作用的化合物，主要包括阿片类如吗啡、 可卡因、 海洛因、 美沙酮，苯丙胺类如苯丙胺、 甲基苯丙胺(冰毒)以及摇头丸、 氯胺酮、 大麻类等. 近年来，违禁药物除部分用于麻醉、 镇痛等医用功能外，在娱乐场所和酒吧、 宾馆等服务场所以及别墅等私密场所被大量使用. 调查显示，2012年世界吸毒人口达到2.43亿，而我国的违禁药物使用量也急剧增加，区域范围不断扩大，已严重危害人民的身心健康，破坏社会秩序. 人类大量使用违禁药物后，其母体化合物或代谢物会随尿液、 粪便等进入污水处理厂，但污水处理厂并没有专门设置去除此类物质的措施，污水处理过程不能将其完全降解，因此已处理甚至未经处理的污水中的违禁药物及其代谢物会最终进入河流、 湖泊等水环境. 大量研究指出，在污水、 地表水甚至饮用水中已检测到此类物质的存在，并会对水生生物正常的生命活动产生潜在的不利影响，破坏生态平衡. 因此，不少学者将其定义为新型环境污染物. 可见，违禁药物的滥用已经不只是社会问题，更是一个不容忽视的严重环境问题. 基于违禁药物重要的社会和环境影响，其精确检测和滥用量估算对流行病学和环境科学具有重要意义. 违禁药物滥用量传统的估算方法主要通过社会流行病学调查进行，但该方法具有很大的局限性和不确定性. 近年来，环境科学界发展了污水流行病学方法，通过测定某个地区污水中违禁药物的残留浓度水平反算该地区违禁药物的用量，具有客观、 实时、 可对比等优点. 大量研究报道了用海洛因的代谢物6-单乙酰吗啡(6-AM)、 可卡因的主要代谢物苯甲酰厄告宁(BE)、 美沙酮的主要代谢物2-亚乙基-1,5-二甲基-3,3-二苯基吡咯烷(EDDP)、 氯胺酮的主要代谢产物去甲氯胺酮(NK)以及未代谢的苯丙胺(AM)、 甲基苯丙胺(METH)、 摇头丸(MDMA)、 氯胺酮(KET)等估算常见违禁药物的污水流行病学方法. 但大部分违禁药物及其代谢物在环境中通常以纳克级每升的浓度水平存在，因此，研究高回收率的前处理方法和高灵敏度、 高选择性的分析测定方法就显得格外重要. 已有研究中，对环境水样的前处理普遍采用固相萃取技术(solid phase extraction，SPE)，以达到净化、 浓缩待测物的目的. 但不同学者选用的SPE前处理步骤、 条件以及SPE柱的类型(如Oasis HLB、 Oasis MCX、 Oasis MAX)等不尽相同. 对常见违禁药物的分析测定，大多数学者选用液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)，并通过采用内标法、 优化色谱和质谱条件等达到准确定量的目的. 亲水作用色谱-串联质谱技术(常用HILIC色谱柱，HILIC-LC-MS/MS)[17, 19, 23, 27]和反相液相色谱-串联质谱技术(常用C18色谱柱，C18-LC-MS/MS)在已有研究中均有报道. 不同的前处理和分析条件下违禁药物的分析效果(如回收率、 检出限)有较大差异. 为提高待测物的回收率，本研究从SPE柱的类型(常用Oasis HLB和Oasis MCX)、 样品pH值和冲洗、 酸化、 复溶过程等方面对前处理条件进行了优化. 本研究还对超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)的两种分析方法HILIC/C18-UPLC-MS/MS的质谱、 色谱条件进行了优化，并用基质效应、 回收率、 准确度和精密度、 检出限和定量限、 线性和范围等指标对HILIC法和C18法进行了评价，确定了最优的SPE前处理条件和适用于常见违禁药物分析检测的UPLC-MS/MS方法. 通过分析北京市污水中的常见违禁药物，对优化的方法进行了验证，以期为在中国全面开展违禁药物的污水流行病学研究及评价违禁药物的环境风险奠定扎实的基础. 1 材料与方法 1.1 材料 违禁药物的标准样品和氘代内标储备液均购自美国的Cerilliant公司 (Round Rock,TX,USA). 其中标准样品包括吗啡(MOR,100 μg·mL-1)、 可卡因(COC,100 μg·mL-1)、 苯甲酰厄告宁(BE,100 μg·mL-1)、 可待因(COD,100 μg·mL-1)、 6-乙酰吗啡(6-AM,100 μg·mL-1)、 美沙酮(MTD,100 μg·mL-1)、 2-亚乙基-1,5-二甲基-3,3-二苯基吡咯烷(EDDP,100 μg·mL-1)、 苯丙胺(AM,10 μg·mL-1)、 甲基苯丙胺(METH,100 μg·mL-1)、 摇头丸(MDMA,75 μg·mL-1)及其代谢物(MDA,100 μg·mL-1)、 氯胺酮(KET,100 μg·mL-1)、 去甲氯胺酮(NK,100 μg·mL-1); 氘代内标包括MOR-D6，COC-D3、 BE-D3、 COD-D6、 6-AM-D6、 MTD-D9、 EDDP-D3、 AM-D8、 METH-D8、 MDMA-D5、 MDA-D5、 KET-D4、 NK-D4(均为10 μg·mL-1). 主要试剂：正己烷、 氨水、 盐酸(均为分析纯)，甲醇(优级纯)，醋酸铵、 甲酸、 甲酸铵、 乙腈(均为液相色谱级). 主要仪器：固相萃取装置(12位固相萃取装置，CNW科技公司)，SPE柱(Oasis MCX和Oasis HLB，均为60 mg 3 mL，购自Waters)，氮吹仪，漩涡振荡仪，离心机，超声仪，液相色谱质谱联用仪(色谱仪Waters ACQUITY UPLC，质谱仪AB Sciex Triple Quad 6500). 1.2 测定方法 1.2.1 质谱条件的优化 根据待测物的性质，选择电喷雾离子源正离子模式ESI(+). 由待测物及其氘代化合物的分子量，设置扫描的荷质比m/z范围，寻找待测物母离子，并优化去簇电压(declustering potential,DP)，得到最大母离子响应. 进行子离子扫描时，选择相应的母离子进行打碎，手动调节和优化碰撞能量(collision energy,CE)，使母离子的强度为图谱中基峰强度的1/4~1/3，得到最佳响应的子离子对，其中每个待测化合物最大丰度的离子对作为定量离子，另一离子对作为定性离子. 1.2.2 色谱条件的优化 本实验对HILIC法和C18法的流动相、 洗脱方式等进行了优化. 综合考虑洗脱能力、 极性等因素，实验选择乙腈作为有机流动相. 为保证待测物的正电离，在有机相和水相中加入一定浓度的甲酸或甲酸铵以改善峰型. 为缩短分析周期、 提高分离能力和灵敏度等，本实验采用梯度洗脱的方式. 1.3 前处理方法 1.3.1 Oasis MCX固相萃取 ①样品过滤：50 mL污水样品过玻璃纤维滤膜; ②MCX柱活化：依次加入6 mL甲醇、 4 mL超纯水和4 mL pH=2的超纯水，流速1~2mL·min-1; ③内标的添加：已过滤水样中添加13种违禁药品的混合内标，静置3~5 min充分混匀; ④样品的加载：加载已添加混合内标的样品，流速1~2mL·min-1; ⑤干燥：真空泵持续抽气15~40 min直至SPE柱干燥; ⑥洗脱：依次用4 mL甲醇和4 mL氨水/甲醇溶液(5/100，质量比)洗脱干燥的MCX柱，流速1~2mL·min-1; ⑦样品浓缩：缓和的氮气流吹洗脱液，直至吹干; ⑧复溶：若最终浓缩液选用HILIC-UPLC-MS/MS测定，需用200 μL乙腈复溶氮吹残留物; 若最终浓缩液选用C18-UPLC-MS/MS测定，需用100 μL乙腈+100 μL 5 mmol·L-1乙酸铵复溶氮吹残留物; ⑨复溶液过滤：0.22 μL离心过滤管过滤复溶后的样品，滤液装入UPLC-MS/MS专用样品瓶，4℃下保存，以备上机测定. 1.3.2 Oasis HLB固相萃取 与Oasis MCX固相萃取方法基本相同，不同之处在于②HLB柱活化：依次加入6 mL甲醇、 6 mL超纯水，流速1~2mL·min-1; ⑥洗脱：8 mL甲醇洗脱干燥的HLB柱，流速1~2mL·min-1. 1.4 方法评价 参照ICH (International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) 指南，选取回收率、 基质效应、 准确度(一般用回收率表示)、 精密度(日内和日间精密度)、 检出限、 定量限以及线性和范围等指标对方法进行评价. 1.4.1 回收率 分别取20、 100和200 μL的100 ng·mL-1混标注入50 mL pH=2的超纯水中，保证复溶后溶液中违禁药物的浓度基本覆盖其在实际污水中的检出浓度. 比较MCX固相萃取前后各待测物的浓度，得到13种待测物在不同浓度梯度下的回收率. 1.4.2 基质效应 选取北京市肖家河污水处理厂进水作为基质效应的供试水样，分别取20、 100和200 μL的100 ng·mL-1混标注入50 mL水样中得到加标水样，不加标的水样作为空白水样，经过MCX固相萃取和UPLC-MS/MS分析测定，比较各待测物在不同浓度梯度下加标水样与空白水样的检测浓度之差和其在相应浓度标准样品中的检测浓度，评价基质对信号的抑制或加强效应. 1.4.3 检出限和定量限 按照ICH的规定，仪器检出限(ILOD)和定量限(ILOQ)分别以3倍信噪比(3S/N)和10倍信噪比(10S/N)确定. 0.01、 0.05、 0.1和0.5 ng·mL-1等低浓度混标上机测定，S/N为3时对应的浓度为仪器检出限，S/N为10时对应的浓度为仪器定量限. 方法检出限(MLOD)和定量限(MLOQ)通过以下公式计算得到：  式中，200 μL为上机浓缩液的体积，50 mL为SPE前处理所取污水样的体积. 1.4.4 线性和范围 基于已报道的实际污水样品中各待测违禁药物的浓度水平，向乙腈中加入不同体积的混合标准溶液和固定体积(50 μL)的氘代内标混合溶液(100 ng·mL-1)，得到浓度范围为0.01~200 ng·mL-1的系列混合工作溶液. 1.4.5 精密度 已加入10 ng混标的pH=2超纯水经过前处理后，一日内平行进样3次，评价方法的日内精密度; 已加入10 ng混标的pH=2超纯水连续3个工作日进行样品前处理并上机测定，评价方法的日间精密度. 日内和日间精密度均用相对标准偏差(RSD)表示，15%的RSD和不精确度作为方法可接受的标准上限. 2 结果与讨论 2.1 优化后的色谱条件 2.1.1 HILIC-UPLC-MS/MS优化后的色谱条件 色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH-HILIC色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm). 优化流动相时，在有机相和水相中加入一定浓度的甲酸后，所得峰仍有拖尾现象，再加入甲酸铵后峰型得到明显改善，优化后的流动相条件为10 mmol·L-1甲酸铵0.2%甲酸水溶液(A相)、 90%乙腈+10 mmol·L-1甲酸铵0.2%甲酸水溶液(B相). 洗脱梯度见表 1，该洗脱条件明显缩短了分析周期，提高了分离能力和灵敏度. 优化后的流速为0.4mL·min-1，柱温为40℃，进样量为1 μL.
表 1 HILIC-UPLC-MS/MS流动相洗脱梯度 2.1.2 C18-UPLC-MS/MS优化后的色谱条件 色谱柱为Waters ACQUITY UPLC CSH-C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm). 在优化流动相时，向有机相和水相中加入一定浓度的甲酸，即可得到理想峰型，优化后的流动相条件为0.1%甲酸水溶液(A相)、 乙腈+0.1%甲酸(B相)，洗脱梯度见表 2，流速为0.4mL·min-1，柱温为40℃，进样量为1 μL.
表 2 C18-UPLC-MS/MS流动相洗脱梯度 2.2 优化后的质谱条件 HILIC/C18-UPLC-MS/MS两种检测方法均采用电喷雾离子源(ESI)，通过多反应监测模式(MRM)对所有待测物进行检测. 离子化模式：ESI(+)，离子源电压(IS)：5 500 V，离子源温度(TEM)： 550℃，气帘气(CUR)压力：35psi，干燥气(GS1)和辅助气(GS2)压力均为50psi，碰撞池气压(CAD)：9psi，去簇电压(DP)：30 V，HILIC法和C18法的待测物及其相应内标的母离子和定量、 定性离子荷质比(m/z)及保留时间(RT)、 碰撞电压(CE)等参数见表 3.
表 3 待测物HILIC/C18-UPLC-MS/MS的质谱参数 由表 3中各待测物的保留时间RT可知，HILIC法得到的METH与AM保留时间均为1.68 min，MDMA与MDA保留时间均为1.65 min，MTD的保留时间1.41 min与EDDP的保留时间1.43 min相近，而C18法得到的所有待测物的保留时间相差较大. 图 1 HILIC法和C18法的色谱图描述了13种违禁药物的出峰情况，从出峰时间来看，C18法能更好地分离待测物.
图 1 13种违禁药物的HILIC-UPLC-MS/MS和C18-UPLC-MS/MS色谱图 2.3 优化后的SPE前处理条件2.3.1 SPE柱和样品pH值对待测物回收率的影响 本实验选用环境水样SPE前处理应用较为广泛的Oasis HLB柱和Oasis MCX柱，研究SPE柱对待测违禁药物回收率的影响. 对HLB柱而言，分别将pH值为2、 7、 11的超纯水过柱，按照1.3.2节中HLB固相萃取方法进行前处理，比较样品pH值对待测药物回收率的影响. 而对MCX柱而言，只将pH值为2的超纯水过柱，按照1.3.1节中Oasis MCX固相萃取方法进行前处理. 由表 4可知，用HILIC法和C18法得到的13种待测物在不同SPE柱和样品pH值条件下的回收率基本相同，均具有一致的变化规律. HLB柱在样品pH值为2、 7、 11时会显著影响METH、 AM、 MOR、 COC、 COD、 MTD、 EDDP等物质的回收率，且METH、 AM、 MOR在样品pH=2以及EDDP在样品pH为2、 7、 11时的回收率均不在80%~120%之间.可见，用Oasis HLB柱前处理得到的大多数待测物回收率受水样pH值影响较大，且不同违禁药物需要的最佳样品pH值不同，因此不适合用Oasis HLB柱前处理水样以进行多种常见违禁药物及其代谢物的同步测定. 相反，用Oasis MCX柱前处理pH=2样品所得的13种待测物回收率均在80%~120%之间，故将Oasis MCX柱作为后续实验及今后实际污水样品前处理的理想SPE柱. 违禁药物用Oasis HLB和Oasis MCX柱进行SPE前处理所得回收率不同的原因，可能是两种SPE柱的吸附剂(填料)不同所致，其中Oasis HLB柱为亲水-亲酯吸附剂，极性基团可增加对极性物质的保留; Oasis MCX柱为混合型强阳离子交换、 水可浸润性聚合物吸附剂，对碱性化合物具有较高的选择性和灵敏度. 而所测违禁药物均具有含N的碱性基团，更适合用Oasis MCX柱进行SPE前处理.
表 4 不同SPE柱和水样pH值条件下的待测物回收率比较% 2.3.2 样品浓缩过程中酸化对待测物回收率的影响 根据1.3.1节中Oasis MCX固相萃取方法，在洗脱液氮吹浓缩过程中，当洗脱液为1 mL左右时分别加入0、 200、 400、 600 μL盐酸/甲醇溶液(5/95，体积比)，研究酸化过程对待测物回收率的影响. 由表 5不同酸化条件下待测物的回收率可知，样品浓缩过程中是否酸化及酸化程度对13种待测物的回收率影响不大，说明氮吹过程不会因待测物的挥发而显著影响其回收率. 因此，实验认为样品浓缩过程无需进行酸化处理.
表 5 不同酸化条件下的待测物回收率比较/% 2.3.3 冲洗步骤对待测物回收率的影响 根据1.3.1节中Oasis MCX固相萃取方法，在样品加载完之后，分别设置3 mL 超纯水、 3 mL 正己烷冲洗Oasis MCX柱和无冲洗3组对照实验，研究冲洗步骤对待测药物回收率的影响. 由表 6不同冲洗条件下待测物的回收率可知，除无冲洗和水洗MCX柱条件下得到的COC回收率较低外，是否冲洗MCX柱及不同冲洗试剂的冲洗对其它12种待测物回收率没有显著影响，因此，样品前处理过程无需进行MCX柱的冲洗.
2.3.3 冲洗步骤对待测物回收率的影响 根据1.3.1节中Oasis MCX固相萃取方法，在复溶过程中设置3组对照实验：①200 μL乙腈复溶氮吹残留物1 min; ②先用100 μL乙腈复溶30 s，再加入100 μL 5 mmol·L-1乙酸铵超纯水溶液复溶30 s; ③400μL乙腈复溶氮吹残留物1 min. 由表 6不同复溶条件下待测物的回收率可知，不同组成和量的溶剂复溶氮吹残留物，浓缩液用HILIC法和C18法测得的待测物回收率没有显著差别. 但C18法色谱图显示，用200 μL和400 μL乙腈复溶得到的KET、 MOR、 NK色谱图均有两个强峰，分别在1.35 min和1.48 min处、 0.63 min和0.66 min处、 1.27 min和1.43 min处，这是上机的溶液中有机相的比例太高而出现溶剂效应所致，而用有机相比例较低的100 μL乙腈+100 μL 5 mmol·L-1乙酸铵复溶得到的KET、 MOR、 NK色谱图均有一个峰，分别在1.48、 0.63、 1.43 min处. 因此，若选用HILIC法测定常见违禁药物及其待测物，可选用200μL乙腈复溶; 若选用C18法测定常见违禁药物及其待测物，需选用100 μL乙腈+100 μL 5 mmol·L-1乙酸铵复溶. 2.4 已优化方法的评价 2.4.1 回收率和基质效应 由表 7可知，HILIC法和C18法测定的回收率和基质效应均基本处于80%~120%之间，说明实验选用MCX固相萃取的前处理方法是可行的. 但总体而言，C18法所得回收率和基质效应较HILIC法更接近于100%.
表 7 HILIC/C18-UPLC-MS/MS的回收率和基质效应比较/% 2.4.2 检出限、 定量限、 线性和范围及精密度 根据表 8两种方法的比较结果，除COD和NK两种待测物用C18法得到的LOD和LOQ高于HILIC法外，METH、 6-AM和MDA这3种待测物用C18法得到的LOD和LOQ均较低，且HILIC法测定MDA的方法LOQ达到20.00 ng·L-1，显然高于其在大多数水环境中的浓度，故用HILIC法很可能掩盖6-AM、 MDA等违禁药物在水环境中的存在; 而AM、 KET等其它8种待测物用两种方法得到的LOD和LOQ相同. HILIC法和C18法得到的所有待测物标准曲线相关系数均在0.99以上，且所有浓度水平基本可达到85%~115%的准确度和RSD<15%的精密度，因此标准曲线可用于实际污水中常见违禁药物及其代谢物浓度的测定. 日内和日间RSD均<2.5%，说明仪器的稳定性、 方法的重复性等都达到了理想的实验要求. 综上，C18法较HILIC法更适合用于中国污水中违禁药物的定量分析.
表 8 HILIC/C18-UPLC-MS/MS的检出限和定量限、 线性和范围及精密度比较 3 检测方法在实际污水样品中的应用 供试实际污水样采自北京市12家污水处理厂，分别为北小河、 北苑、 卢沟桥、 高碑店、 酒仙桥、 小红门、 吴家村、 永丰、 温泉、 清河、 方庄和肖家河污水厂，总服务人口为1 114.6万，占北京市常住人口的51.4%; 污水总处理量为285.4万m3·d-1，其中最大处理量为95.0万m3·d-1(高碑店污水厂)，最小处理量为2.0万m3·d-1(永丰和温泉污水厂). 污水样采于2015年5月18~20日和6月2~3日，每个污水厂采样两天，进、 出水同时采集，为自动采样器采集的24 h混合水样. 根据2.3节中SPE前处理条件的优化结果，实验选用1.3.1节中Oasis MCX固相萃取的步骤对北京污水样进行前处理. 由表 3待测物HILIC/C18-UPLC-MS/MS的质谱参数中各待测物的保留时间RT可知，C18法对13种常见违禁药物及其代谢物的分离效果更好; 此外，表 7、 表 8中的方法评价指标显示，C18法具有较低的检出限和定量限以及较为理想的回收率和基质效应. 综合考虑以上因素，实验选用C18法测定北京市污水厂进、 出水中常见违禁药物及其代谢物的浓度，并计算其去除率. 结果表明，选用上述前处理和上机测定方法基本能准确检测所有常见违禁药物及其代谢物在污水厂进、 出水中的浓度，能够满足实验要求. 其中，北京市污水厂进水中METH、 MOR、 COD浓度较高，METH浓度范围为17.44~305.60 ng·L-1，MOR浓度范围为21.82~273.00 ng·L-1，COD浓度范围为15.36~213.80 ng·L-1; 其次为AM 1.96~42.30 ng·L-1、 BE 1.30~15.70 ng·L-1、 6-AM 3.72~9.36 ng·L-1、 MDA 2.68~9.40 ng·L-1、 EDDP 1.00~24.60 ng·L-1; KET、 COC、 MDMA、 MTD和NK基本处于<5 ng·L-1的浓度水平. 北京市12家污水厂进水中主要违禁药物或代谢物的浓度见图 2.
图 2 北京12家污水厂进水中的主要违禁药物或代谢物浓度 由表 9的去除率数据可知，METH、 MOR、 AM和COD的去除率较高，基本在85%以上; 其次为MDA，去除率基本在70%以上; 其它违禁药物或代谢物的去除率均较低，甚至存在负去除的现象，如海洛因的代谢物6-AM、 可卡因的代谢物BE、 氯胺酮的代谢物NK以及COC、 MDMA等去除率较低，可能原因是违禁药物在污水处理过程中进一步分解为代谢产物，导致出水中代谢物的浓度偏高，或者同一污水厂进水和出水的采样时间不对应，导致所采的出水并不是所采的进水经过处理后的对应水样. 此外，值得注意的是，出水水样中待测物的浓度多为几ng·L-1，与文献报道的污水厂不能将违禁药物及其代谢物完全去除的结论相符. 因此，污水厂出水中的违禁药物或代谢物进入河流、 湖泊等水环境，将会对生态平衡产生潜在的威胁.
表 9 北京市12家污水厂对常见违禁药物及其代谢物的去除率/% 4 结论 (1) SPE前处理条件的优化结果表明，污水样的前处理应调水样pH值为2，选用Oasis MCX柱，无需MCX柱的冲洗和氮吹过程的酸化步骤. 若选用C18-UPLC-MS/MS上机测样，应用100 μL乙腈+100 μL 5 mmol·L-1乙酸铵复溶氮吹残留物; 若选用HILIC-UPLC-MS/MS上机测样，可直接用200 μL乙腈复溶. (2) 根据待测物的保留时间及检出限、 定量限、 回收率和基质效应等方法评价指标，用C18法所得结果具有分离效果更好、 检出限和定量限更低、 回收率和基质效应更接近于100%等优点，因此实验确定将C18-UPLC-MS/MS作为实际污水样的理想测定方法. (3) 前处理和上机测定方法在北京市12家污水厂的实际污水样中得到应用和验证，除个别去除率高的待测物在出水中未能检出外，绝大多数待测物均被检出并准确定量. 其中，METH、 MOR、 COD在进水中的浓度较高，METH、 MOR、 AM、 COD的去除率较高，而其它待测物的去除率较低甚至存在负去除的现象. 此外，污水厂出水中检出了几ng·L-1的违禁药物及其代谢物，将对水环境的生态平衡构成潜在威胁. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
