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A2/O工艺对城市生活污水毒性去除效果分析污水处理厂污水成份复杂，常含有一些难以降解的微量污染物，例如关注较多的农药、医药、个人护理品以及内分泌干扰物等.污水处理厂出水在达到现行常规指标要求时，对这些微量污染物的去除效果并不佳.因此，污水厂出水成为水环境中微量污染物的主要来源.这些微量污染物进入水环境后会影响水生生物的正常生长、发育、繁殖，进而导致生态系统结构破坏.通常，人们采用一些化学分析法对水样中的微量污染物进行定性或者定量分析，例如高效液相色谱、气相色谱、高效液相色谱-质谱法等.但这些化学分析方法需要较高的费用以及熟练的操作技术，并且这些微量污染物共存于水环境时，可能会产生拮抗、协同或者加和作用，故单个物质浓度不能反映水样的生物效应.目前，污水处理厂出水成为水环境健康的一个重要的潜在危险源.例如，Sponza发现纸浆和造纸厂出水达到了行业的排放标准，但生物毒性检测结果发现其对鱼类和藻类具有急性毒性.周海东等研究表明污水处理厂虽能较好地去除内分泌干扰物，但污水厂的出水仍具有潜在的环境风险.为实现城市污水的资源化和无害化，有必要对污水处理前后的生物毒性进行全面的检测和评价.多数研究采用不同类型的单一生物毒性方法对工业废水和生活污水进行评价，而利用成组生物实验并采用综合毒性评价方法对污水毒性削减程度进行评价的研究尚缺乏. 本研究利用发光菌急性毒性实验、遗传毒性实验和雌激素活性实验检测了A2/O工艺对城市生活污水毒性的去除效果，并采用水质安全分级法对生物毒性进行综合评价;同时通过雄性斑马鱼暴露实验分析了水样对水生生物产生内分泌干扰作用的机制，以期为污水处理工艺运行参数优化及工艺改进提供理论依据，进一步保障受纳水体的生态安全. 1 材料与方法 1.1 实验试剂 苯酚(phenol)、4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NOQ)、邻硝基酚β-D-半乳糖苷(ONPG) 和雌二醇(E2) 购自Sigma公司. HPLC级甲醇、乙酸乙酯购于天津科密欧公司. 1.2 水样的采集和预处理 从污水处理厂的细格栅、曝气沉砂池、初沉池、好氧池、二沉池以及出水(加氯消毒后，如图 1) 各采集3 L水样于棕色玻璃容器中，并立即带回实验室进行预处理.其中1 L水样用于发光菌急性毒性和遗传毒性实验，2 L水样用于雌激素活性检测和斑马鱼暴露实验.水样经玻璃纤维膜(0.8 μm, Millipore, GF/F) 过滤后进行固相萃取.水样中的诸如雌二醇(E2)、雌酮(E1)、雌三醇(E3) 以及双酚A等雌激素或类雌激素属于弱极性物质[11]，根据相似相溶原理，针对不同的生物毒性，本研究采用不同的萃取方法，具体步骤如下.
图 1 A2/O工艺流程及取样点 对于发光菌急性毒性和遗传毒性实验，水样的萃取方法参照Ma等的研究，依次用14 mL甲醇、10 mL超纯水活化Oasis HLB (200 mg，6 mL，Waters) 柱子;水样以流速5~10 mL·min-1过柱，然后用10 mL超纯水清洗管路，干燥30 min，离心15 min去除水份;进样完毕，用10 mL甲醇洗脱，洗脱液用氮气吹干;最后用1% DMSO将残留物溶解，定容至5 mL用于实验. 对于雌激素活性和斑马鱼暴露实验，水样的萃取方法参照王昌稳等的研究，依次用10 mL乙酸乙酯、10 mL甲醇和10 mL超纯水对上述柱子进行活化;水样以流速5~10 mL·min-1过柱，然后用10 mL超纯水清洗管路，干燥30 min，离心15 min去除水份;进样完毕，用10 mL乙酸乙酯洗脱，洗脱液用氮气吹干;最后用1 mL纯DMSO溶解浓缩至2 000倍，吸取其中500 μL浓缩液用于雌激素活性，剩余浓缩液稀释至400 mL (浓缩2.5倍) 用于斑马鱼暴露实验. 1.3 发光菌急性毒性实验 发光菌毒性测试采用国际标准ISO 11348急性毒性15 min暴露方法，实验菌种为费氏弧菌(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心).实验前将保存的菌种转接于50 mL的液体培养基中，在20℃，180 r·min-1条件下进行培养，当其处于对数生长后期时，用2% NaCl稀释菌液使其相对发光值为300~400万RLU;将100 μL浓缩的样品、阳性对照(苯酚) 以及100 μL菌液加入96孔板，在检测仪上高速振荡30 s，摇匀，暴露15 min后测定发光值.每个样品设置3个平行，并设置板间平行.样品的RLU平均值记为I，空白对照的RLU平均值记为I0.根据公式(1) 计算不同浓缩倍数的污水的发光抑制率E.  1.4 遗传毒性实验 本实验采用由Oda博士(日本大阪府立公共卫生研究所) 提供的鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimuriumTA1535/pSK1002菌株，具体实验方法参照ISO 13829将新下平板的菌株接种到LB培养基中，在37℃，180 r·min-1条件下培养，当其在600 nm的吸光度为2.2±0.2时，用TGA稀释10倍，放置摇床培养1.5~2 h，使菌液在600 nm的吸光度为0.75±0.5. 96孔板1板中B~H排加入1%的DMSO 180 μL，A排加入浓缩的样品360 μL，用排枪混匀后吸出180 μL加入B排，混匀，再吸出180 μL至C排，依次至F排. G排为溶剂对照(1% DMSO)，H排为阳性对照(4-NOQ) 和空白对照.除空白外，每孔加入70 μL菌液，37℃下振荡培养2 h. 1板结束后，每孔取30 μL加至含有270 μL TGA培养基的96孔板2板中，37℃下振荡培养2 h，用酶标仪测定600 nm的吸光度.从2板每孔取30 μL加至含有120 μL B-buffer的96孔板3板中. 3板每孔加30 μL ONPG，28℃下振荡培养0.5 h，最后加入120 μL Na2CO3终止反应，用酶标仪测定420 nm的吸光度.实验过程未加S9代谢活化剂.实验设置3个平行，并设板间平行，根据公式(2) 和公式(3) 计算结果:  式中, G为生长因子，IR为诱导率;G>0.5时可用于计算IR;IR≥1.5可判断致突变阳性;A600, T、A600, B、A600, N、A420, T、A420, B、A420, N分别为测定样品、空白对照和溶剂对照在600 nm、420 nm处的光密度值. 1.5 雌激素活性 雌激素活性采用中国科学院生态环境研究中心建立的酵母菌雌激素活性评价方法.将酵母菌置于SD培养基中，30℃、130 r·min-1条件下培养36 h.用SD培养液稀释菌液，使其在600 nm的吸光度值为0.75左右，吸取995 μL菌液于1.5 mL灭菌离心管中，加入5 μL待分析的样品混匀，每个样品设置8个浓度.取200 μL的混合菌液到96孔板中，每个浓度设置3个平行，30℃、800 r·min-1条件下暴露4 h.测定菌液600 nm的吸光度，随后每孔弃去150 μL，加入120 μL测试缓冲液和20 μL氯仿，1 200 r·min-1振荡15 min，然后加入40 μL ONPG，于30℃、800 r·min-1下培养，显色60 min后，每孔加入100 μL碳酸钠溶液，终止反应.吸取上清液200 μL至新96孔板中，测定420 nm的吸光度.同时以DMSO做溶剂对照，E2为阳性对照. β-半乳糖苷酶活性(U) 按公式(4) 计算:  式中，t为加入ONPG到溶液显色时的反应时间，60 min;V为菌液体积，0.2 mL;A600、A420分别为菌液在600 nm、420 nm处的光密度值;A′420为空白对照在420 nm的光密度值;D为稀释因子(6.6). 由剂量效应曲线得出β-半乳糖苷酶活性(U) 后，根据最小二乘法如公式(5) 计算水样的EC50.  式中，y为β-半乳糖苷酶活性;X为水样浓缩倍数;A为最大β-半乳糖苷酶活性;B为回归曲线中点的斜率;C为半数最大β-半乳糖苷酶活性时水样的浓缩倍数(EC50);D为本底β-半乳糖苷酶活性. 1.6 水质安全分析 由于水体中污染物种类繁多，每种物质引起的毒性不同，因此选用多组生物毒性检测方法进行评价更有意义. Xu等建立了基于多种生物毒性检测的水质安全评价方法，本文采用该方法对水样进行评价，具体方法如下:通过对传统风险外推法进行改进，提出毒性的4个得分指标: 1、2、3、4;数字越大，毒性越强.根据引起显著毒性效应的水样最低浓度将毒性测试结果转化为毒性得分，在此基础上，对水样的3种毒性得分进行汇总，提出水质安全分级指标A、B、C、D，水质安全性依次降低，由毒性测试结果中最差的得分值确定水质的安全级别.将各生物毒性结果用当量表示，样品的毒性当量与阳性对照的可预测无效应浓度(PNEC) 进行对比，参照水质分析标准确定样品的得分如表 1所示.在本研究中，阳性对照的PNEC值基于物种敏感性分布(SSDs).
表 1 水质安全性评价指标1) 1.7 斑马鱼暴露实验 将6条驯化良好的成熟雄性斑马鱼暴露于400 mL浓缩2.5倍的水样中(污水厂进水、二级出水以及地表水进水) 和空白(DMSO<0.01)，并设置3个平行.每48 h更新一次溶液，暴露周期为8 d，暴露期间未喂食.在暴露终点时，随机取出5条斑马鱼，并立即转移至冰块上麻痹，待其冻僵后，用蒸馏水清洗鱼体，解剖镜下解剖，取出肝脏和生殖腺，迅速放入预冷的TRIzol试剂中，用RNA试剂盒(Takara, Japan) 提取肝脏和生殖腺的总RNA.用微量分光光度计测定RNA在260 nm和280 nm的吸光值A260和A280，当A260/A280的比值介于1.8~2.0之间时，方可用于实验.经反转录提取的RNA转录成cDNA.在GenBank上查得斑马鱼雌激素受体(esr1) 和卵黄原蛋白基因(vtg1) 的mRNA序列.实验选取不受环境和组织器官影响的18S rRNA作为参比引物，引物使用前用无菌ddH2O稀释到10 μmol·L-1.定量PCR的过程参考文献[17]进行操作.最终结果用相对定量2-ΔΔCt计算. 1.8 数据处理 发光菌急性毒性和雌激素活性用半数效应浓度EC50表示，而遗传毒性用“遗传毒性潜力值” IR1.5定量比较水样的遗传毒性大小.为了便于不同样品间进行比较，将所有样品的毒性折算成具有相同效应的阳性对照的浓度，其中发光菌毒性和遗传毒性当量分别用TEQphenol、TEQ4-NOQ表示，雌激素活性用EEQE2表示，即TEQphenol=EC50-phenol/EC50-样品、TEQ4-NOQ=IR1.5-4-NOQ/EC50-样品、EEQE2=EC50-E2/EC50-样品.斑马鱼暴露实验结果采用GraphPad®Prism5软件进行作图.利用Newman-Keuls方法进行处理组和对照组之间的差异性分析，P≤0.05表示具有显著性差异. 2 结果与讨论 2.1 发光菌急性毒性 水样对发光菌的发光抑制的剂量-效应曲线如图 2所示.在本实验中，阳性对照苯酚的EC50为2.82 mmol·L-1，与袁星等[19]研究结果相接近(2.35 mmol·L-1)，验证了该方法的可靠性.各样品毒性采用浓缩倍数N表示，当抑制率为50%时，进水、曝气沉砂池、初沉池、好氧池、二沉池以及出水的浓缩倍数N分别为1.44、0.94、1.86、12.67、12.79、24.70.将样品毒性结果用TEQphenol表示，以上样品的TEQphenol分别为184.97、283.36、143.59、21.03、20.83、10.78 mg·L-1.毒性由大到小依次为:曝气沉砂池>进水>初沉池>好氧池>二沉池>出水.本实验中曝气沉砂池的毒性大于进水毒性，这可能是由于一些物质以共轭的形式存在于环境中，而经过曝气沉砂池时变成非共轭形式或者被激活而表现出毒性，最终出现曝气沉砂池的急性毒性增加的现象.总体而言，随着工艺流程的进行，发光菌急性毒性降低.尤其是经过好氧池后，发光菌急性毒性降低92.58%.由此可以得出二级生物处理能大幅度降低污水的急性毒性.经过加氯消毒后，出水的毒性降低48.24%.王丽莎等[9]利用发光菌毒性测试对某污水厂再生水处理工艺进行测定，发现进水发光菌发光抑制率为63%，二沉池出水为0%，加氯消毒后提高到93%，说明加氯消毒能增大出水毒性.塔春红等研究表明在正常浓度水平下的无机副产物(ClO2-和ClO3-) 均不表现出急性毒性，消毒后生物毒性的增加主要由消毒副产物引起.而投氯量是影响消毒副产物产生的一个重要因素.该处理工艺可能存在氯投加量过多的现象，导致有些消毒副产物同余氯发生反应或者降解，消毒副产物生成量增加后出现减小的趋势，造成急性毒性降低.
2.2 遗传毒性 本实验以4-NOQ为阳性对照，其IR1.5-4-NOQ的值为19.58 μg·L-1.当4-NOQ的浓度为50 μg·L-1，IR的值为3.38，与国际标准ISO13829具有可比性，说明该方法的可行性.水样的遗传毒性的剂量-效应曲线如图 3所示，当IR=1.5时，进水、曝气沉砂池、初沉池、好氧池、二沉池以及出水的浓缩倍数N分别为1.15、0.92、1.89、43.79、48.64、111.50.将上述样品的遗传毒性用TEQ4-NOQ表示，分别为17.02、21.28、10.36、0.447、0.403、0.17 μg·L-1.遗传毒性的顺序依次为:曝气沉砂池>进水>初沉池>好氧池>二沉池>出水.在本实验中，曝气沉砂池的遗传毒性大于进水，这可能是由于曝气沉砂池的曝气和水流的螺旋旋转作用，使污水中悬浮颗粒相互碰撞、摩擦，并受到气泡上升的冲刷作用，导致砂粒上附着的有机成分被剥离而溶于水中引起.除曝气沉砂池以外，随着工艺流程进行遗传毒性降低.其中，好氧池对遗传毒性的去除率高达95.68%，因此二级处理工艺能够显著地降低遗传毒性.加氯消毒后，污水出水的遗传毒性降低57.82%，该结果和污水对发光菌的荧光抑制毒性具有一致性.造成加氯消毒后遗传毒性降低的原因如发光菌急性毒性所述，投氯量较多时，消毒副产物被分解.
图 3 水样的遗传毒性的剂量-效应曲线 2.3 雌激素活性 本实验中阳性对照E2的EC50为15.05 ng·L-1，与Beck等[26]研究相比(EC50=48.96 ng·L-1)，该方法的灵敏度较高，适用于广范围的水样类型.水样的β-半乳糖苷酶活性的剂量-效应关系如图 4所示.水样的雌激素活性用浓缩倍数N表示时，进水、曝气沉砂池、初沉池、好氧池、二沉池以及出水的EC50分别为2.07、2.02、2.45、7.57、8.29、7.89.将上述样品用EEQE2表示时，其EEQE2分别为7.29、7.45、6.15、1.98、1.82、1.89 ng·L-1.与急性毒性、遗传毒性类似，曝气沉砂池的雌激素活性最强.人体的尿液中，雌激素以共轭的形式存在，通过物质之间的化学作用或者微生物酶的作用，曝气沉砂池中的雌激素以自由态的形式被释放，这可能导致雌激素活性增加.整体而言，雌激素活性也随着流程的进行逐渐降低.其中，好氧池对雌激素活性的去除率高达72.84%.这种去除效果可能是由于微生物的降解和污泥的吸附作用.尤其是A2/O工艺具有延长生物处理的特点，在脱氮除磷过程中，氨氧化菌可将雌激素物质硝化，进而产生雌激素活性较低的产物，如E1和E2的硝化产物的活性低于母体本身.而加氯消毒没有降低出水的雌激素活性，这可能是由于在消毒过程中产生的消毒副产物具有雌激素活性, 从而导致出水的雌激素活性比较恒定的现象，例如E1、E2和EE2的消毒副产物具有与母体相当的雌激素活性.
图 4 水样雌激素活性的剂量-效应曲线 Jarošová等指出当水环境的EEQE2高于1 ng·L-1会对水生生物产生一定的危害. Vethaak等[32]曾报道河流的EEQE2为0.17 ng·L-1时，可导致雄鱼体内卵黄原蛋白显著性上升.本实验污水的出水的EEQE2为1.89 ng·L-1, 故其有可能对受纳水体的水生生物产生潜在的危害. 2.4 水质安全评价 在3种体外生物毒性测试的基础上，通过SSD法计算得出PNECphenol为2.94 mg·L-1，参照Xu等得出的PNEC4-NOQ(0.64 μg·L-1) 和PNECE2(2 ng·L-1) 值，结合水质风险分级评价方法，对各流程出水进行了水质安全评价研究，结果如图 5所示.进水的生物毒性得分最高，其中急性毒性和遗传毒性得分为3，雌激素活性得分为2[图 5(a)]，水质安全级别为C级，属于较差的水质.经曝气沉砂池和初沉池处理后，污水水质安全级别并没有提高[图 5(a)].经过好氧池处理之后，发光菌毒性得分为2，遗传毒性和雌激素活性得分为1，水质级别提高到B级[图 5(b)]，经二沉池和加氯消毒处理之后，出水水质安全性没有得到进一步改善，水质级别仍为B级[图 5(b)].显然污水的雌激素活性对水质安全性影响最小，而发光菌急性毒性对其影响最大.由此可知，根据污染物具有的主要生物毒性效应而采取针对性的处理工艺更有利于水质达到安全性级别.本实验中，虽然生物毒性都得到降低，但污水的急性毒性效应未使出水水质达到安全性级别，可能会对周围的生态环境产生潜在的生态危害.
图 5 污水各处理工艺出水的安全性级别 2.5 斑马鱼暴露实验 综上所述，污水出水仍会对受纳水体的水生生物带来一定的风险.本研究进一步通过雄性斑马鱼实验了解水样对水生生物的毒性机制.实验过程中斑马鱼未出现死亡.雄性斑马鱼的肝脏和生殖腺内的esr1基因和vtg1基因表达如图 6所示.污水厂进水、二级出水以及地表水进水浓缩2.5倍后，导致雄性斑马鱼肝脏和生殖腺的vtg1表达上升[图 6(a)和6(c)]. vtg1的诱导是卵生脊椎动物体内出现雌激素效应的一个标志.因此本实验表明了水样对雄性斑马鱼产生雌激素效应.研究过程中，通过化学分析检测到水样中的主要雌激素为E2和乙炔雌二醇(EE2)(数据待发表)，地表水进水中的E2和EE2浓度接近EC50(导致斑马鱼体内卵黄原蛋白基因表达量达到最大值一半时的浓度). Thorpe等指出将斑马鱼暴露在浓度为1 ng·L-1的EE2和E2时，可观察到卵黄原蛋白的生成.因此，本实验中雄性斑马鱼体内vtg1的增加是持续暴露在水样中的必然结果.
图 6 暴露在进水、二级出水和地表水进水中的雄性斑马鱼生殖腺和肝脏的目的基因(esr1和vtg1) 的变化 生殖腺中的esr1的表达受到抑制[图 6(b)]，说明水样对雄性斑马鱼具有抗雌激素效应.该结果和酵母菌体外检测相反，这可能由以下两方面原因引起:首先，水样成份复杂存在抗雌激素物质，如4-n壬基酚具有一定的抗雌激素作用;其次，生物体具有代谢能力，一些物质体内的代谢产物可能比母体化合物具有更强的生物毒性，例如防晒剂二苯甲酮-3作为二苯甲酮-4的代谢产物具有更强的抗雌激素作用而较弱的雌激素作用.而酵母菌缺乏一定的代谢能力，可能会产生和体内检测不一样的结果.研究还发现雄性斑马鱼肝脏内的esr1有微弱的表达[图 6(d)]，这个结果和vtg1的上升以及酵母菌检测具有一致性，进一步说明了水样的雌激素效应. esr1表达水平的变化说明了同一个基因在不同的组织器官的表达可能具有差异性.因此，在毒性效应分析时应从多个基因水平和多个组织或器官考虑，以获得比较全面的信息.总之，体内检测揭示了水样对斑马鱼的内分泌干扰作用可通过干扰相关基因的表达来完成. 3 结论 (1) 初级处理对污水的急性毒性、遗传毒性和雌激素活性的去除效果微弱，而二级生物处理对污水的生物毒性效应具有显著的削减作用. (2) 城市生活污水原水的水质安全性较差，其中发光菌急性毒性对水质安全性的影响较大，经A2/O工艺处理之后，出水水质安全性得到提高，但污水出水的雌激素活性水平仍会对受纳水体的水生生物产生潜在的危害. (3) 污水可通过干扰目的基因的表达来调控水生生物的内分泌且调控方式与组织器官相关. |
